etude-des-proprietes-de-la-polyphenol-oxydase-ec1-4-18-1-du-champignon-de-paris-agaricus-bisporus-j-e-lange-imbach

Abstract

La polyphénol oxydase (PPO; EC 1.14.18.1) du champignon de Paris (Agaricus bisporus (J.E. Lange) Imbach) est extraite en milieux aqueux à l'aide d'une poudre d'acétone. L'extrait brut obtenu est partiellement purifié par précipitation par l'acétone suivie d'un fractionnement au sulfate d'ammonium à 60%. Cette enzyme possède deux activités, monophénolase et diphénolase mesurées par spectrophotométrie à 420 et 475 nm pour le pyrogallol et la L-tyrosine, respectivement. Un taux de purification de 2 fois est obtenu pour les deux activités, par la précipitation au sulfate d'ammonium. Les activités monophénolase et diphénolase, sont respectivement 3.35 UE/ml et 189.3 UE/ml. La PPO reste stable à -15°C pendant 44 jours. L'enzyme n'est pas très thermostable. Son activité diphénolase diminue lorsqu'elle est incubée à des températures supérieures à 35°C. Elle se caractérise par deux pH optimaux, (5.3 et 7.0 à 25°C), quand le pyrogallol est utilisé comme substrat et La vitesse initiale d'oxydation de ce dernier dépend de la concentration de l'enzyme. L'activité diphénolase est optimale à pH 7.5 lorsque le pyrocatéchol est utilisé comme substrat. Une faible activité laccase représentant seulement 0.22% de l'activité totale de l'enzyme a été mesurée. Les mono-, di- et triphénol ont été des substrats pour la PPO. Utilisant VmaX/Km comme constante de spécificité, le pyrocatéchol est le meilleur substrat suivie par le pyrogallol. Les paramètres cinétiques de l'enzyme sont : V.« = 80 UE/min/ml, Km = 1.4 mM et Ks = 250 mM pour le pyrogallol et Vm = 168 UE/min/ml, Km = 0.40 mM et Ks = 270 mM pour le pyrocatéchol. L'inhibition de la PPO du champignon de Paris a été étudiée avec l'acide benzoïque, l'azide de sodium et le fluorure de sodium comme inhibiteurs, le pyrocatéchol et le pyrogallol comme substrats. La PPO du champignon de Paris a été fortement inhibée par les inhibiteurs testés. L'analyse cinétique de l'inhibition de l'activité triphénol oxydase montre que l'acide benzoïque et l'azide de sodium sont des inhibiteurs compétitifs, avec des valeurs K1 de 0.0498 et 3.22 mM, respectivement. L'inhibition par le fluorure de sodium est mixte-type I, avec des constantes K1 de 81.08 mM et Ki5 de 161.14 mM pour le pyrogallol utilisé comme substrat. L'activité diphénol oxydase montre une inhibition mixte-type I avec l'azide de sodium. Les valeurs de Ki et K15 sont respectivement, 1.39 et 3.12 mM. Une inhibition de type compétitif est obtenue avec l'acide benzoïque utilisé comme inhibiteur. La constante d'inhibition K1 étant de 0.046 mM. Une inhibition mixte-type II est obtenue avec le fluorure de sodium en utilisant le pyrocatéchol comme substrat, avec K1 =148.97 mM et Kis = 49.19 mM. Les valeurs d'1050 sont estimées à 0.147 mM, pour l'acide benzoïque, 3.20 mM pour l'azide de sodium et 123.94 mM pour le fluorure de sodium. L'acide benzoïque, au vu de la faible valeur Ki, est apparemment l'inhibiteur le plus efficace, lorsque le pyrogallol et le pyrocatéchol sont utilisés comme substrats. La cinétique de l'inactivation thermique de la PPO peut être correctement décrite par un modèle de premier ordre à des températures comprises entre 45°C et 73°C avec les différents temps de traitement. La dénaturation de cette enzyme, mesurée par la perte d'activité, pourrait être décrite comme une réaction de premier ordre avec des valeurs de k comprises entre 0.0046 et 1.79 min-1. Les valeurs k et D diminuent et augmentent, respectivement, avec l'augmentation de la température, indiquant une inactivation rapide de la PPO à des températures supérieures. Les valeurs de l'énergie d'activation (Ea) et Z'r sont égales respectivement à 208.37 kJ/mol (R2 = 0.9667) et 10.10°C (R2 = 0.9559). Le traitement thermique, pendant 30 mm, à 52.5°C et à 60°C provoque une inactivation de l'enzyme de l'ordre de 50% et 80%, respectivement. Le brunissement enzymatique du champignon, pourrai être très ralenti voir inhibé soit par inactivation thermique ou par action de l'acide benzoïque. Mots clés: Champignon de Paris, Agaricus bisporus, Polyphenol oxydase, Purification, Inhibition, Inactivation thermique, Brunissement enzymatique. 'H Abstract Polyphenol oxidase (PPO; EC 1.14.18.1) from mushrooms (Agaricus bisporus (J.E. Lange) Imbach) was extracted in aqueous medium from acetone powder. The enzyme crude extract was than partially purffied by acetone precipitation followed by precipitation with ammonium suiphate at 60%. The enzyme exhibited both monophenolase and diphenolase activities that were measured spectrophotometrically at 420 and 475 nm using L-tyrosine and pyrogallol as substrates, receptively. A two-fold purification in both activities was achieved by ammonium sulfate fractionation. The monophenolase activity was 3.35 EU/ml, and the diphenolase activity was 189.3 EU/ml. PPO was relatively stable at -15°C for 44 days. The enzyme was flot very heat stable, and its activity decreased when incubated at the temperatures higher than 35° C. PPO activity showed two pH optima, at 5.3 and 7.0 at 25°C when pyrogallol was used as the substrate. Diphenolase activity of PPO was optimal at pH 7.5 when pyrocatechol was used as substrate. The initial rate of pyrogallol oxidation depends also on the enzyme concentration. A negligible laccase activity was observed and represented only 0.22 % of the activity total PPo. Mono-, di- and triphenols were substrates for PPO. Using VmX/Km as a specfficity constant, pyrocatechol was the better substrate followed by pyrogallol. The kinetic parameters of the enzyme were: V. = 80 EU/min/ml, Km = 1.4 mM and Ks = 250 mM for pyrogallol and Vmax = 168 EU/min/ml, Km = 0.40 mM and Ks = 270 mM for the pyrocatechol. The inhibition kinetics of mushroom PPO with benzoic acid, sodium azide and sodium fluoride as inhibitors, and pyrocatechol as substrate were reported. Mushroom PPO was significantly inhibited by ai of the tested inhibitors. With regard to triphenol oxidase activity, kinetic analysis revealed that inhibition by benzoic acid and sodium azide were of the competitive-type, with K1 values of 0.0498 and 3.22 mM, respectively. The inhibition by sodium fluoride was of the mixed-I type, with a K1 of 81.08 mM and Kis of 161.14 mM for pyrogallol as a substrate. Diphenolase activity exhibited the mi.xed-I type inhibition with sodium azide (Ki and K15 values of 1.39 and 3.12 mM, respectively). Competitive-type inhibition was obtained when benzoic acid was used as an inhibitor; the inhibition constant K1 was found to be 0.046 mM. A partial mixed-type inhibition pattern was obtained with sodium fluoride when using pyrocatechol as a substrate, with a Kj of 148.97 mM and a Kis of 49.19 mM. The 1050 values were estimated to be 0.147, 3.20, and 123.94 mM for benzoic acid, sodium azide, and sodium fluoride, respectively. Furthermore, benzoic acid was the most effective inhibitor when pyrogallol and pyrocatechol were used as substrates because of its low Ki value. The resuits showed that the type of inhibition was dependent upon both the origin of the PPO and on the substrate. Kinetic studies of the thermal inactivation showed that mushroom PPO followed monophasic kinetics that can be adequately described by a first-order model at temperatures range of 45°C to 73°C with différent exposure times. Denaturation of this enzyme, measured by loss in activity, could be described as a first-order reaction with k values between 0.0046 and 1.79 min-1. D- and k-values decreased and increased, respectively, with increasing temperature, indicating faster PPO inactivation at higher temperatures. Activation energy (E9) and Z1' values were calculated as 208.37 kJ/mol (R2 0.9667) and 10.10 °C (R2 = 0.9559) respectively. Heat treatment at 52.5°C and 60°C for 30 min resuited in 50% and 80% inactivation of enzymatic activity. Inhibition of PPO by benzoic acid or its thermal inactivation could be very useful to control enzymatic browning of mushroom. Keywords: Mushroom, Agaricus bisporus, Polyphenol oxidase, Purification, Inhibition,